λ噬菌體基因組DNA快速提取試劑盒-現(xiàn)貨
λ噬菌體載體廣泛用于文庫篩選，目的克隆培養(yǎng)獲得大量的噬菌體顆粒需要提取λ噬菌體DNA來開展測序等后續(xù)工作。λ噬菌體裂解培養(yǎng)物離心后的上清，首先用RNase A /DNase I混合酶消化去除殘留的宿主菌DNA/RNA，沉淀收集噬菌體，噬菌體被SDS裂解，殘留碎片通過沉淀離心去除掉。λ噬菌體基因組DNA快速提取試劑盒-現(xiàn)貨
λ噬菌體基因組DNA快速提取試劑盒（離心柱型）
λ噬菌體基因組DNA快速提取試劑盒-現(xiàn)貨
目錄號：40212
目錄編號 | 包裝單位 |
40212-50 | 50次 |
40212-100 | 100次 |
v 適用范圍：
適用于快速λ噬菌體DNA
v 試劑盒組成、儲存、穩(wěn)定性：
試劑盒組成 | 保存 | 50次 | 100次 |
RNase A | -20℃ | 20 mg | 20 mg X 2 |
DNase I | -20℃ | 50mg | 50 mg X 2 |
噬菌體沉淀液 | 室溫 | 100ml | 100ml X 2 |
裂解緩沖液 | 室溫 | 30ml | 60ml |
雜質(zhì)沉淀液 | 室溫 | 5ml | 10ml |
結(jié)合液LB | 室溫 | 20ml | 40ml |
漂洗液WB | 室溫 | 15ml | 25ml |
洗脫緩沖液EB | 室溫 | 10ml | 15ml |
吸附柱AC | 室溫 | 50個 | 100個 |
收集管（2ml） | 室溫 | 50個 | 100個 |
本試劑盒在室溫儲存12個月不影響使用效果。
儲存事項:
1. 在RNase A管和DNase I管分別加入1毫升的裂解緩沖液吹打，顛倒混勻，充分溶解RNase A和DNase I后， 按照每次使用量分裝－20℃凍存，有效期6個月。
2. 結(jié)合液LB低溫時可能出現(xiàn)析出和沉淀，可以在37℃水浴幾分鐘幫助重新溶解，恢復澄清透明后冷卻到室溫即可使用。
3. 避免試劑長時間暴露于空氣中產(chǎn)生揮發(fā)、氧化、pH值變化，各溶液使用后應(yīng)及時蓋緊蓋子。
v 產(chǎn)品介紹：
λ噬菌體載體廣泛用于文庫篩選，目的克隆培養(yǎng)獲得大量的噬菌體顆粒需要提取λ噬菌體DNA來開展測序等后續(xù)工作。λ噬菌體裂解培養(yǎng)物離心后的上清，首先用RNase A /DNase I混合酶消化去除殘留的宿主菌DNA/RNA，沉淀收集噬菌體，噬菌體被SDS裂解，殘留碎片通過沉淀離心去除掉。裂解物上清中的λ噬菌體DNA在高離序鹽狀態(tài)下選擇性吸附于離心柱內(nèi)硅基質(zhì)膜，再通過一系列快速的漂洗－離心的步驟，將鹽、細胞代謝物、蛋白等雜質(zhì)去除，最后低鹽的洗脫緩沖液將λ噬菌體DNA從硅基質(zhì)膜上洗脫。
v 產(chǎn)品特點：
1. 不需要使用有毒的苯fen等試劑，也不需要乙醇沉淀等步驟。
2. 節(jié)省時間，簡捷，可用于液體培養(yǎng)裂解物和固體培養(yǎng)板的提取，單個樣品操作一般可在1.5小時內(nèi)完成。
3. 產(chǎn)量高，典型的產(chǎn)量10ml λ噬菌體裂解培養(yǎng)物上清可以提取約10µg λ噬菌體DNA。
4. 多次柱漂洗確保高純度，OD260/OD280典型的比值達1.7～1.9。可以直接用來酶切和測序。
v 注意事項：
1. 使用轉(zhuǎn)速可以達到13,000rpm的冷凍離心機。
2. 開始實驗前將需要的水浴先預(yù)熱到37℃?zhèn)溆谩?/span>
3. 需要自備氯仿，20％SDS。
4. 結(jié)合液LB含有刺激性化合物，操作時要戴乳膠手套，避免沾染皮膚，眼睛和衣服。若沾染皮膚、眼睛時，要用大量清水或者生理鹽水沖洗。
v 操作步驟：（實驗前請先閱讀注意事項）
以10 ml噬菌體感染細菌培養(yǎng)上清提取舉例：
提示：
e 第一次使用前請先在漂洗液WB中加入指ding量無水乙醇，充分混勻，加入后請及時在方框打鉤標記已加入乙醇，以免多次加入!
e 將噬菌體沉淀液放在冰上預(yù)冷。
1. 將0.5% lv仿處理后的λ噬菌體感染的液體培養(yǎng)物10,000g（約12,000rpm）4℃離心10分鐘去除細胞碎片和殘渣。
轉(zhuǎn)速不能過高，時間不能過長，否則噬菌體可能和碎片一起沉淀，降低產(chǎn)量。
2. 取10ml上清，加入20μl RNase和20μl DNase充分混勻37℃溫育30分鐘。
每個噬菌體培養(yǎng)上清因生長和裂解情況不同而殘留RNA/DNA量不等。RNase/DNase消化過頭，可能減少產(chǎn)量；消化不wan全，可能未消化的DNA/RNA和細胞碎片粘去部分噬菌體減低產(chǎn)量并/或者導致最后污染宿主菌DNA，因此應(yīng)該根據(jù)實際情況適當調(diào)節(jié)用量和消化時間。
3. 加入2 ml 冰預(yù)冷的噬菌體沉淀液，輕柔充分混勻后置冰上冷卻（培養(yǎng)板裂解物必須在冰上放置30分鐘）。
4. 10,000g（12,000rpm）4℃離心10分鐘，棄上清，干燥1分鐘。沉淀下來的噬菌體外觀為透亮或者稍白的沉淀。
5. 加入500μl裂解緩沖液，吹打重懸噬菌體，加入100μl 20％SDS，立即輕柔顛倒混勻4-6次后，70℃溫育10分鐘，然后置冰上冷卻。
6. 加入100μl雜質(zhì)沉淀液，立即輕柔顛倒混勻4-6次，最高速13,000g 4℃離心10分鐘。
7. 仔細將上清轉(zhuǎn)入新的離心管，加入350μl結(jié)合液LB，輕柔渦旋混勻。
8. 將上述混合物加入一個吸附柱AC中，（吸附柱放入收集管中）12,000rpm離心30秒，倒掉收集管中的廢液。
吸附柱一次最多只可以容納大約700μl混合物，因此需要分次把混合物上到吸附柱內(nèi)，重復步驟8。
9. 加入700μl漂洗液WB（請先檢查是否已加入無水乙醇!），12,000rpm 離心30秒，棄廢液。
10. 可選步驟：重復步驟9一遍。
11. 將吸附柱AC放回空收集管中，13,000rpm離心2分鐘，盡量除去漂洗液， 以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應(yīng)。
12. 取出吸附柱AC，放入一個干凈的離心管中，在吸附膜的中間部位加100μl洗脫緩沖液EB（洗脫緩沖液事先在 50℃水浴中預(yù)熱），室溫放置1分鐘，12,000rpm 離心1分鐘。如果想得到較多量的DNA，可將得到的溶液重新加入離心吸附柱中，12,000rpm離心1分鐘。
洗脫體積越大，洗脫效率越高，如果需要DNA濃度較高，可以適當減少洗脫體積， 但是最小體積不應(yīng)少于40μl，體積過小降低DNA洗脫效率，減少DNA產(chǎn)量。
13. DNA可以存放在2-8℃，如果要長時間存放，可以放置在-20℃。
v 問題與解決方法:
問題 | 評論與建議 |
低核酸產(chǎn)量或者純度不高 | * 試劑盒儲存在非最佳條件-建議：收到試劑盒后總是存放在室溫（15℃-20℃）。 * 緩沖液或者試劑暴露于減少它們有效性的條件下-建議：儲存在室溫（15℃-20℃），每次用完后立刻蓋緊蓋子，以免溶液蒸發(fā)，pH改變和污染。 * 漂洗液WB中忘記加無水乙醇-建議：第一次實驗時，在漂洗液WB中加入指ding量無水乙醇。 * 試劑和樣品沒有充分混勻-建議：加入每個試劑后都要充分混勻。 * 噬菌體上清滴度太低-建議：1.確認λ噬菌體已經(jīng)wan全裂解了宿主菌（加入0.5%的氯仿可以幫助wan全裂解）；2.離心去除宿主菌碎片殘渣時間不能超過10分鐘，轉(zhuǎn)速不超過10,000g，否則否則噬菌體也可能和碎片一起沉淀丟失；3.重新培養(yǎng)一次噬菌體感染細菌。 * DNase I/RNase消化不足或者過頭-建議：消化過頭，可能減少產(chǎn)量并導致最后污染宿主菌DNA；消化不wan全，可能未消化的DNA，RNA和細胞碎片粘去部分噬菌體，因此可以適當調(diào)節(jié)用量。 |
宿主菌基因組DNA殘留過高 | * DNase I/RNase失活或者反應(yīng)條件不佳-建議：DNase I/RNase必須溶解在裂解緩沖液中，必須分裝凍存。λ噬菌體必須用LM(含鎂離子)培養(yǎng)，在其它培養(yǎng)肉湯中，DNase消化活性可能受到影響。 |
加入噬菌體沉淀劑后未見到λ噬菌體沉淀 | * 不適合的離心溫度和離心力。-建議：10,000g（12,000rpm）4℃離心10分鐘。 * 上清中含λ噬菌體太少-建議：離心前，樣品置冰上冷卻。參見前面滴度太低解決辦法 |
λ噬菌體基因組DNA快速提取試劑盒-現(xiàn)貨
