NobleRyder 嘌呤霉素儲存液（1mg/ml）
NobleRyder 嘌呤霉素儲存液（1mg/ml）NobleRyder 即用型液體試劑 C0836-1mLNobleRyder 即用型液體試劑 C0836-5×1mL
Puromycin是來源于Streptomyces alboniger的一種氨基核苷類抗生素，中文名為嘌呤霉素，常用于篩選通過質粒轉染/轉化、病毒感染等方法能表達pac基因(puror)的真核或原核多克隆或單克隆細胞。Puromycin不僅用于穩定細胞株的篩選，也用于穩定細胞株的維持。
Puromycin的特點是快速作用于細胞，一般2天內可以殺死99%的不表達pac基因的細胞。
在革蘭氏陽性菌、動物或昆蟲細胞中，嘌呤霉素通過抑制蛋白質合成而抑制或殺死細胞。其作用機制為嘌呤霉素是氨酰-tRNA分子3'末端的類似物，能夠與核糖體的A位點結合并摻入到延伸的肽鏈中。嘌呤霉素與A位點結合后，不會參與隨后的任何反應，從而導致蛋白質合成的提前終止并釋放出C-末端含有嘌呤霉素的不成熟多肽。
Pac基因表達嘌呤霉素N-乙酰轉移酶(Puromycin N-acetyl-tranferase)，該基因是在Streptomyces alboniger中發現的。如果表達基因，就會對嘌呤霉素產生抗性，這一特性目前普遍應用于篩選表達pac基因的哺乳動物穩定細胞株等。例如，很多商業化的慢病毒載體都攜帶pac基因(一般在質粒圖譜上標記為puror)，從而利用嘌呤霉素篩選特定基因的穩定表達細胞株。嘌呤霉素也可以用來篩選表達pac基因的大腸桿菌菌株、酵母菌株等。
NobleRyder 嘌呤霉素儲存液（1mg/ml）
使用方法
1.建議使用濃度
哺乳動物細胞：1-10 μg/mL，優良濃度需要殺滅曲線來確定；
大腸桿菌：LB瓊脂培養基篩選穩定轉化pac基因的大腸桿菌，使用濃度為125μg/mL。注：使用嘌呤霉素篩選大腸桿菌穩轉株需要精確的pH值調節，而且受宿主細胞本身的影響。
2. 嘌呤霉素殺滅曲線的確定（以shRNA轉染或者慢病毒轉導為例）
嘌呤霉素有效篩選濃度跟細胞類型、生長狀態、細胞密度、細胞代謝情況及細胞所處細胞周期位置等有關。為了篩選到穩定表達的shRNA細胞株，確定殺死未轉染/轉導細胞的*低濃度嘌呤霉素至關重要。建議初次做實驗的客戶一定要建立適合自身實驗體系的殺死曲線（kill curve）。
1） Day 1：24孔板內以5~8 x 104 cells/孔的密度鋪板，鋪足夠量的孔以進行后續的梯度實驗。37℃細胞孵育過夜；
2） Day 2：a）準備篩選培養基：含不同濃度嘌呤霉素的新鮮培養基（如0-15μg/mL，至少5個梯度）；b）往孵育過夜后的細胞內更換新鮮配制的篩選培養基；之后37℃孵育細胞；
3） Day 4：更換新鮮的篩選培養基，并觀察細胞存活率。
4） 根據細胞的生長狀態，約2-3天更換新鮮的篩選培養基；
5） 每日監測細胞，觀察存活細胞率，從而確定抗生素篩選開始4-6天內有效殺死非轉染或者所有非轉導細胞的藥物*低濃度。
3. 哺乳動物穩定轉染細胞株的篩選
等轉染含有pac基因的質粒后，細胞在含有嘌呤霉素的培養基中增殖，以篩選出穩定轉染子。
1）細胞轉染48h后，將細胞（原樣或稀釋）置于含有適當濃度嘌呤霉素的新鮮培養基中培養。
注意：當細胞處于分裂活躍期時，抗生素作用*明顯。細胞過于密集，抗生素產生的效力會明顯下降。最好進行細胞分盤使其密度不超過25%。
2）每隔2-3天，移除和更換含有嘌呤霉素的培養基。
3）篩選7天后評估細胞形成的病灶。病灶可能需要額外的一周或者更多時間，這依賴于宿主細胞系和轉染篩選效率。注意：每日進行細胞生長狀態的觀察。嘌呤霉素的篩選至少需要48h，有效濃度嘌呤霉素的篩選周期一般在3-10天。
4）轉移和放置5-10個抗性克隆到一個35mm的培養皿中，用選擇培養基繼續培養7天。此次富集培養是為日后的細胞毒性實驗做準備。
注意事項
1）為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
NobleRyder 嘌呤霉素儲存液（1mg/ml）
